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細胞毒素煥發新活力：一種可應用于納米孔技術、疫苗開發和腫瘤治療的細菌毒力因子ClyA

上世紀90年代，Ludwig研究團隊首次發現：在大腸埃希氏菌K-12菌株中過表達傷寒沙門氏菌調控蛋白SlyA會導致合成一種新的細胞溶解素ClyA，使重組大腸埃希氏菌表現出溶血表型。ClyA是一種34kDa的孔道形成毒素，可由包括大腸桿菌和沙門氏菌在內的某些腸桿菌科細菌產生[1]。

自ClyA被發現以來，許多研究對它的結構、功能以及毒力作用進行了探索。ClyA在細菌胞內合成可溶性單體后，通過外膜囊泡轉運至胞外，在經歷大規模構象變化后在宿主細胞膜上形成環狀復合物跨膜孔道（圖1），從而造成宿主細胞的溶解和凋亡。

                  圖1：ClyA分泌及孔組裝途徑

ClyA在細菌毒力方面起著重要作用，同時，近年研究表明ClyA在生物技術應用方面也存在巨大的潛力。這一“古老”的毒素蛋白在納米孔技術、疫苗開發和腫瘤治療方面煥發了新的活力。孔道毒素可形成蛋白通道的結構性質使其被廣泛應用于生物學“納米孔”系統，實現無需標記、化學修飾或表面固定的單分子分析。Maglia研究團隊首次證明了ClyA在其納孔腔內可以容納原生態折疊的蛋白質。隨后的研究報告進一步證實了ClyA在作為檢測單個大分子的生物納孔方面的實用性[2]。ClyA還被應用于開發無電極納米孔傳感方法，可以在無電的情況下對單分子進行光學監測。

ClyA通過外膜囊泡（OMVs）介導的分泌方式使其成為將外源蛋白或抗原傳遞到OMVs的理想融合蛋白和支架，使目標蛋白或抗原能夠成功展示在釋放的OMVs表面。目前，工程化的ClyA-OMV系統已應用于開發多種病原體疫苗。當把完整的鮑曼不動桿菌Omp22蛋白與ClyA融合后展示在大腸埃希氏菌OMVs表面。接種工程化的OMVs可以誘導小鼠產生抗原特異性體液免疫應答，從而產生免疫保護。此外，Yang研究團隊報道了攜帶ClyA和SARS-CoV-2刺突蛋白受體結合域（RBD）融合蛋白的細菌仿生囊泡（BBV），并將這一系統與高壓均質技術相結合進一步增強了RBD在BBV上的展示以及RBD-BBV的產量；在皮下注射RBD-BBV使其積聚在淋巴結中，促進抗原的吸收和處理，從而引發小鼠對SARS-CoV-2的特異性體液和細胞免疫應答[3]。

在腫瘤治療方面，Ryan等人首次證明了融合了缺氧誘導啟動子的ClyA可增強腫瘤缺氧區域的壞死，并可抑制小鼠腫瘤生長[4]。另一項研究使用ClyA-OMV系統成功實現了程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）外域的展示。工程化的OMVs結合在腫瘤細胞表面的PD-1配體1上，從而促進PD-1配體1的內化，并降低其在腫瘤細胞上的表達水平。Thomas等人的最新研究顯示，透明質酸酶（Hy）通過ClyA錨定在OMVs表面，使Hy更有效、更均勻地在腫瘤內分布，促使藥物滲透并通過大幅降低腫瘤組織中透明質酸水平來增強藥效。這些結果表明ClyA-OMV系統可能是進行基質重塑、溶細胞療法以及提高抗癌靶向治療活性的有效工具。

參考文獻：

1.Ludwig, A.; Tengel, C.; Bauer, S.; Bubert, A.; Benz, R.; Mollenkopf, H.J.; Goebel, W. SlyA, a regulatory protein from Salmonella typhimurium, induces a haemolytic and pore-forming protein in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 1995, 249, 474–486.

2.Franceschini, L.; Brouns, T.; Willems, K.; Carlon, E.; Maglia, G. DNA Translocation through Nanopores at Physiological Ionic

Strengths Requires Precise Nanoscale Engineering. ACS Nano 2016, 10, 8394–8402.

3.Huang, W.; Wang, S.; Yao, Y.; Xia, Y.; Yang, X.; Li, K.; Sun, P.; Liu, C.; Sun, W.; Bai, H.; et al. Employing Escherichia coli-derived

outer membrane vesicles as an antigen delivery platform elicits protective immunity against Acinetobacter baumannii infection. Sci.

Rep. 2016, 6, 37242.

4.Ryan, R.M.; Green, J.; Williams, P.J.; Tazzyman, S.; Hunt, S.; Harmey, J.H.; Kehoe, S.C.; Lewis, C.E. Bacterial delivery of a novel cytolysin to hypoxic areas of solid tumors. Gene Ther. 2009, 16, 329–339.